熒光光度計的操作要點?

一、操作前準備：奠定實驗基礎(chǔ)

1. 儀器與環(huán)境檢查

• 儀器狀態(tài)確認：開機前檢查電源、數(shù)據(jù)線連接是否牢固，樣品室門是否關(guān)閉（部分儀器需 “關(guān)門" 狀態(tài)才能啟動），檢測器、光源（如氙燈）是否處于正常待機狀態(tài)（氙燈壽命有限，避免頻繁開關(guān)）。

• 環(huán)境控制：

• 溫度：保持實驗室溫度穩(wěn)定（通常 20-25℃），避免溫度波動導(dǎo)致儀器部件（如光電倍增管）靈敏度變化；

• 濕度：濕度≤60%，防止光學(xué)元件受潮發(fā)霉（可配備除濕機）；

• 避光：關(guān)閉樣品室附近強光（如直射燈光），避免環(huán)境光干擾熒光信號檢測；

• 防震：儀器需放置在穩(wěn)定臺面上，遠離離心機、真空泵等震動源，防止光學(xué)系統(tǒng)錯位。

2. 試劑與樣品準備

• 試劑純度：空白溶劑（如去離子水、乙醇）需 “熒光級" 或高純度（如 HPLC 級），避免雜質(zhì)自身熒光干擾；標準品需準確稱量、配制，濃度梯度覆蓋樣品預(yù)期濃度（通常 5-7 個梯度，確保線性關(guān)系）。

• 樣品預(yù)處理：

• 去除雜質(zhì)：若樣品含懸浮物、顆粒物，需通過離心（3000-5000rpm，5-10min）或 0.22μm 濾膜過濾，防止堵塞樣品池或散射光干擾；

• 濃度適配：樣品濃度過高易導(dǎo)致 “熒光猝滅"（信號飽和），需提前稀釋至線性范圍內(nèi)（可先做預(yù)實驗判斷濃度范圍）；

• pH 調(diào)節(jié)：部分物質(zhì)熒光強度受 pH 影響顯著（如氨基酸、黃酮類），需用緩沖液（如 Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液）調(diào)節(jié)樣品與標準品 pH 一致。

3. 樣品池選擇與清潔

• 材質(zhì)適配：

• 常用石英樣品池（透光性好，紫外 - 可見區(qū)無吸收），避免使用玻璃池（玻璃對紫外光有吸收，會削弱激發(fā)光）；

• 根據(jù)樣品體積選擇規(guī)格（如 10mm 光程、3.5mL 容量的石英池為常規(guī)款），確保樣品量覆蓋光程（液面需高于進光孔 2-3mm）。

• 清潔流程：

1. 新樣品池先用 10% 硝酸浸泡 2-4h，再用去離子水沖洗 3-5 次，烘干備用；

2. 每次使用后，立即用樣品溶劑（如乙醇）沖洗 3 次，再用去離子水沖洗，最后用無塵紙吸干外壁水分（避免擦拭內(nèi)壁，防止劃痕）；

3. 若樣品殘留（如蛋白質(zhì)、油脂），可用超聲清洗儀（20-30℃，5-10min）清洗，禁用強腐蝕性試劑（如濃鹽酸）。

二、核心操作步驟：規(guī)范流程保準確

1. 儀器啟動與預(yù)熱

1. 打開電腦，啟動熒光光度計控制軟件（如 PerkinElmer 的 FL WinLab、Hitachi 的 F-7000 軟件）；

2. 開啟儀器主機電源，選擇 “氙燈" 或?qū)?yīng)光源（部分儀器需手動點亮光源），預(yù)熱 30min（關(guān)鍵步驟！光源和檢測器需穩(wěn)定后才能檢測，否則信號漂移大）；

3. 預(yù)熱期間，在軟件中設(shè)置儀器參數(shù)（提前規(guī)劃，減少預(yù)熱后等待時間）。

2. 參數(shù)設(shè)置：匹配物質(zhì)熒光特性

3. 空白校正：消除背景干擾

• 目的：扣除溶劑、樣品池、環(huán)境光的背景熒光信號，確保檢測信號僅來自待測物質(zhì)。

• 操作：將空白溶劑注入石英池（液面至刻度線，避免外壁殘留液體），用無塵紙擦拭外壁后，放入樣品室的 “樣品架" 中（注意方向：光程面正對光路，不可反放），點擊軟件 “空白校正" 或 “調(diào)零"，待校正完成后取出空白池。

4. 標準曲線繪制

1. 按濃度從低到高的順序，依次將標準品溶液注入樣品池，放入樣品室，點擊 “測量"，記錄每個濃度對應(yīng)的熒光強度（F）；

2. 測量完一個標準品后，用下一個標準品溶液潤洗樣品池 2-3 次（避免交叉污染），再注入新溶液測量；

3. 全部標準品測量完成后，在軟件中以 “濃度（C）" 為橫坐標、“熒光強度（F）" 為縱坐標，生成標準曲線，計算線性回歸方程（R2 需≥0.998，否則需重新配制標準品）。

5. 樣品檢測與數(shù)據(jù)處理

1. 用樣品溶液潤洗樣品池 2-3 次，注入樣品溶液，放入樣品室，點擊 “測量"，記錄樣品的熒光強度（F 樣）；

2. 若樣品需稀釋，需記錄稀釋倍數(shù)（n），將 F 樣代入標準曲線方程，計算樣品的 “稀釋后濃度"，再乘以 n 得到 “樣品原始濃度"；

3. 每個樣品建議平行測量 3 次，取平均值（相對標準偏差 RSD 需≤5%，確保重復(fù)性）。

6. 實驗結(jié)束后操作

1. 關(guān)閉光源（如氙燈），等待儀器冷卻 10-15min 后，關(guān)閉主機電源和電腦；

2. 立即清洗樣品池（按 “操作前準備" 中的清潔流程），晾干后收納；

3. 清理樣品臺，記錄儀器使用日志（包括使用時間、樣品類型、光源狀態(tài)、異常情況等）；

4. 關(guān)閉實驗室電源、空調(diào)、燈光，確保環(huán)境安全。

三、關(guān)鍵注意事項：規(guī)避誤差與儀器損傷

1. 光源使用禁忌：

• 氙燈啟動后需預(yù)熱穩(wěn)定，禁止在預(yù)熱過程中關(guān)閉電源（易導(dǎo)致燈管損壞）；

• 單次使用時間不宜過長（建議≤4h），若中途暫停實驗，可開啟 “待機模式"（部分儀器有此功能），而非頻繁開關(guān)光源。

2. 樣品池操作規(guī)范：

• 拿取樣品池時，僅接觸磨砂面（避免指紋污染透光面，指紋會產(chǎn)生散射光，干擾信號）；

• 樣品池放入樣品室時，需確保 “定位準確"（部分儀器樣品架有卡槽），若位置偏移，會導(dǎo)致光程不一致，數(shù)據(jù)偏差。

3. 信號干擾防控：

• 避免樣品中含強熒光雜質(zhì)（如灰塵、有機物），若空白信號過高，需更換更高純度的溶劑或重新預(yù)處理樣品；

• 檢測過程中禁止打開樣品室門（開門會導(dǎo)致環(huán)境光進入，信號驟升，甚至損壞光電倍增管）。

4. 數(shù)據(jù)有效性判斷：

• 標準曲線線性差：檢查標準品是否變質(zhì)、配制是否準確，或儀器參數(shù)（如狹縫、PMT 電壓）是否合適；

• 樣品信號飽和（超過滿量程）：需稀釋樣品后重新檢測，避免 “熒光猝滅" 導(dǎo)致結(jié)果偏低；